Науково-методичний семінар для студентів 4 курсу хіміко-біологічного факультету

В рамках студентського наукового гуртка кафедри анатомії і фізіології людини та тварин «Імпульс» 11 березня 2019 р. доцентом Шевченко С.І. було проведено науково-методичний семінар на тему «Вивчення структури клітин і тканин з використанням програмного забезпечення для їх морфо метричного аналізу» для студентів 4 курсу хіміко-біологічного факультету.

Сергій Іванович акцентував увагу студентів, що трансмісійний  електронний мікроскоп (ТЕМ) є одним з найбільш ранніх інструментів, використовуваних для характеристики аутофагії, і він залишається одним з найнадійніших методів моніторингу аутофагії в клітинах і тканинах. Проте, інтерпретація даних ТЕМ вимагає спеціальних знань. Існує кілька критеріїв для точного опису аутофагосоми і аутолізосоми. Відмінною рисою аутофагосоми є їх подвійні або мультимембранні структури, що містять електронно-щільний  матеріал з щільністю, аналогічній цитоплазми.

Наявність в аутофагосомах органел, таких як мітохондрії, хлоропласти, що містять в собі аутофаголізосоми, мають більш темний колір, і нагадують лізосоми цитоплазми. Інші цитоплазматичні утворення можуть бути помилково описані як аутофагосоми і аутофаголізосоми.

Іноді типова подвійна структура мембрани аутофагосоми може бути порушена, наприклад після інфікування деяких патогенних мікроорганізмів. Тому, неупереджена і чітка ідентифікація аутофагосоми з використанням ТЕМ вимагає запобіжних заходів.

Використання величезного світового досвіду у вивенні ПКС тваринної клітини, рекомендацій NCCD (Номенклатурний комітет з клітинної смерті),   проведення чіткої аналогії в ідентифікації отриманих результатів, поєднання методів  біохімічних досліджень з методами мікрокопічних досліджень стане основним у вивченні смерті рослинної клітини

Аутофагія – це деградація органел і цитоплазматичного матеріалу, яка відбувається за участю внутрішньоклітинних мембранних структур. Подібно до дріжджів та тваринних клітин, рослинні клітини демонструють декілька типів аутофагії. Мікроаутофагія – це поглинання клітинних компонентів вакуолярною мембраною. Макроаутофагія має місце подалі від вакуолі. В рослин вона здійснюється аутолізосомами, які значною мірою відрізняються від аутофагосом, знайдених у дріжджах та тваринних клітинах, так як містять гідролази від початку їхнього формування. Інший тип аутофагії у  рослинних клітинах названий мегафагією або мегааутолізом – це масова деградація клітин наприкінці одного типу запрограмованої смерті клітин. Знайдено докази аутофагії специфічних білків при внутрішній дегенерації хлоропластів.

Процес утворення аутофагосом розпочинається в цитоплазмі з утворенням чашкоподібної (cape-shape) мембранної структури, так званої фагофори або ізолюючої мембрани, яка поступово розширюючись, захоплює компоненти клітини і потім захлопується, утворюючи зрілу аутофагосому. Зовнішня мембрана аутофагосоми згодом зливається з тонопластом. При цьому в люмен вакуолі вивільняється  так зване «аутофагічне тіло» – її вміст оточений однією мембраною, яка згодом деградується вакуолярними кислими гідролазами. Продукти деградації при цьому можуть знову транспортуватися в цитоплазму. Деградація аутофагосомального вмісту може проходити і у самих аутофагосомах, оскільки вони містять гідролітичні ферменти. Таким чином, в ході аутофагії деградація клітинного вмісту може здійснюватися як шляхом злиття аутофагосом з центральною літичною вакуолею, так і в самих аутофагосомах.

На сьогодні залишається невідомим взагалі, як проявляється апоптоз у рослин, що за своїми проявами досить схожий з апоптозом у тварин. Важливі компоненти апоптозного ланцюга у тваринній і рослинній клітинах можуть бути взаємно замінні: відбувається виражена конденсація хроматину з наступним розпадом ядра, клітинна мембрана стає пухирчатою, і утворюються гігантські вакуолі. У більшості випадків у рослин вакуолізація цитоплазми передує руйнуванню ядра і мітохондрій.

Нещодавно групою вчених встановлено, що використання терміну «апоптоз» для рослин не виправдано, було запропоновано виокремити такі її типи: вакуолярну загибель та некроз. Вакуолярна клітинна смерть розглядається як комбінація аутофагії, здійснюваної вакуолями і супроводжується збільшенням їх розмірів, і подальшого вивільнення гідролаз з літичних вакуолей в результаті розриву мембрани вакуолей (тонопласту). При цьому морфологія клітинних органел і цілісність плазматичної мембрани клітини зберігається до моменту розриву тонопласту. На противагу цьому, некротична смерть супроводжується швидким розривом плазматичної мембрани, стисненням протопласту, порушенням функціонування мітохондрій, активним накопиченням форм кисню і відсутністю характерних ознак вакуолярної смерті.

Вакуолі відіграють істотну роль в ПКС, яка відбувається не тільки в процесі розвитку рослинних організмів, але і при гіперчутливій відповіді (ГВ), викликаній зараженням рослин вірусними, бактеріальними або іншими патогенами. Описано два сценарії розвитку подій. При вірусній інфекції відбувається лізис тонопласту з вивільненням літичних ферментів вакуолей в цитоплазмі. Це має біологічний сенс, так як переважна більшість вірусів рослин розмножується саме в цитоплазмі.

При бактеріальному або грибковому зараженні патоген перебуває поза клітиною рослини – в міжклітинній рідині, званою апопластом. Для боротьби з деякими не клітинними патогенами вакуолярна мембрана здатна зливатися з плазмалемою, дозволячи гідролітичним ферментам вакуолі виходити в позаклітинний простір.

Залежно від способу видалення компонентів аутофагію поділяють на селективну і неселективну. При селективній аутофагії цитоплазма та інші органели поглинаються аутофагосомами невибірково. У свою чергу, селективна аутофагія є цілеспрямованою і вимагає спеціальних білків-рецепторів для видалення певних компонентів. При селективній аутофагії білки сімейства Atg8 виступають як рецептори.

Що стосується рослин, то специфічні білки і фактори, залучені в аутофагію компонентів протоплазми клітин, виділяють: мітофагію, хлорофагію, ліпофагію, рибофагію, ліпофагію, ксенофагію.

Таким чином, вивчення методів цитологічних досліджень аутофагії допоможе зрозуміти механізми самовідновлення та омолодження організмів в цілому.